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真菌毒素檢測(cè)技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)（1）
發(fā)布時(shí)間： 2009/3/27 點(diǎn)擊次數(shù)： 3079次提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數(shù)： 174 次 資料類型： 瀏覽次數(shù)： 3079 次 相關(guān)產(chǎn)品： 詳細(xì)介紹： 液相色譜法測(cè)定谷物中赭曲霉毒素含量
摘要：研究了液相色譜法測(cè)定谷物中赭曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)乙腈水（84：16）提取，提取液通過(guò)PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。對(duì)添加兩個(gè)濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數(shù)分別為0.281%、1.214%，zui低檢測(cè)限為0.20ng/kg，方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確精密度高，值得推廣。Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in grains .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習(xí)性，分為倉(cāng)儲(chǔ)霉菌和田間霉菌。赭曲霉毒素（簡(jiǎn)稱OTA）是溫暖地區(qū)zui重要的倉(cāng)儲(chǔ)毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。在熱帶和亞熱帶地區(qū)主要由曲霉菌產(chǎn)生，而溫暖地區(qū)則由青霉屬產(chǎn)生。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長(zhǎng)，據(jù)有關(guān)調(diào)查該毒素污染在飼料原料和配合飼料中普遍存在，陽(yáng)性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，據(jù)報(bào)道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對(duì)家畜主要攻擊腎臟、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，肝臟變得脆弱，劇渴，生長(zhǎng)遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已證明OTA對(duì)人可能是致癌的。有建議指出OTA引起地方腎病和膀胱腫瘤。但 FAO/WHO專家協(xié)會(huì)指出，以上這些結(jié)論證據(jù)不足，其他的腎毒性可能起著重要作用（WHO2002）。一些國(guó)家已經(jīng)制定*，歐盟對(duì)麥片的*是5ug/ml3.根據(jù)中國(guó)國(guó)家有關(guān)規(guī)定，玉米中赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.現(xiàn)常用的檢測(cè)方法多為薄層色譜和酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時(shí)長(zhǎng)，而酶聯(lián)免疫法雖操作簡(jiǎn)單，但存在假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性欠佳，此液相色譜法操作簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確靈敏度高，不失為一種好方法。1.實(shí)驗(yàn)部分：1.1試劑和儀器乙 腈（色譜純） 冰醋酸（分析純） 去離子水赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)液：10ug/ml 溶劑為乙腈PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱Waters2695液相色譜儀熒光檢測(cè)器1.2步驟1.2.1 取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時(shí)取樣量加大，有地方建議取15kg。1.2.2 提取：取25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶?jī)?nèi)，加100ml乙腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時(shí)，用定量濾紙過(guò)濾。1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個(gè)棕色瓶子里吹干，用10ml的流動(dòng)相進(jìn)行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液；另將1 ml10ug/ml的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內(nèi)吹干，用10ml的流動(dòng)相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.4 凈化濃縮：取7ml的樣品提取液進(jìn)一玻璃試管內(nèi)（與前處理柱配套提供）（加標(biāo)時(shí)取7ml的空白樣品分別加10ul和35ul的1ug/ml的赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)溶液）,加70ul的冰已酸，混合，用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化萃取液,然后將凈化液，轉(zhuǎn)移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?/span>400ul的流動(dòng)相（60/40/1水/乙腈/乙酸）溶解，渦旋30min ，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管內(nèi)10000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移350ul 的清潔樣品進(jìn)入液相。1. 3儀器條件Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測(cè)器色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm流動(dòng)相：60/40 水/乙腈流速：0.5ml/min 運(yùn)行時(shí)間：20min柱溫：40℃進(jìn)樣體積：60ulEX:330nm EM:460nm2. 0測(cè)定結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本參數(shù)：濃度范圍1.02.05.010.020.030.050.0峰面積103454.993210799.985515389.9641064099.9262285364.8403442139..7605463738.891相關(guān)系數(shù)0.9995回歸方程Y=1.11×105X-1.85×103檢測(cè)限0.20ng/kg（按3倍信噪比計(jì)算）2.2不同濃度添加回收實(shí)驗(yàn)：取玉米樣品1份，分別做兩個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2.兩個(gè)濃度的樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：組分本底值添加標(biāo)準(zhǔn)液的體積10ul35ul赭曲霉毒素0添加處理后理論濃度14.28ng/ml50.0ng/ml添加次數(shù)1234512345添加后測(cè)得濃度（ng/ml）14.1814.1614.1314.2014.1052.0652.1651.1351.6850.69回收率99.3099.1698.9599.4498.74104.12104.32102.26103.36101.38平均值99.12103.09RSD（%）0.2811.2142.3精密度實(shí)驗(yàn)：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測(cè)定8次，結(jié)果見(jiàn)表3表3.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)次數(shù)12345678平均值RSD樣品1測(cè)定值11.2311.4611.4111.3611.8711.9711.6711.7511.592.27樣品2測(cè)定值（ng/ml）28.5728.6228.6828.9828.8728.1228.9228.5328.660.9633.0結(jié)論：此方法簡(jiǎn)便易行，快速準(zhǔn)確，靈敏度高，檢測(cè)限低，適合大批量檢測(cè)，值得推廣4.0參考文獻(xiàn)：王若軍,苗朝華,張振雄.中國(guó)飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調(diào)查報(bào)告.<<飼料工業(yè)>>2004.2（21）.:25（3）G.. Buttinger, E.Fuchs,H.Knapp,F.Berthiller,2004,Performance of new clean-up column for the determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD.Food Additives and Contaminants,11,1107-1114.